长沙水体微生物多样性测序诊断

宏基因组测序的挑战：背景干扰，病原样本深藏在大量宿主和其它微生物之内，临床病原常为起始量低，背景噪音大的复杂样本，大量宿主信号掩盖了微量病原信号，致使敏感性偏低，难以有效区分。另外，因为RNA病毒需先转化为互补DNA(cDNA)再进行测序，因此病原宏基因组测序技术对RNA病原体检出率比DNA病毒更低。可以考虑对核酸样本进行特殊的处理，对病毒序列进行特异性富集，再进行建库测序。质量控制：病原宏基因组测序技术涉及一系列繁琐的实验操作过程，例如文库构建涉及到基因组打断，测序接头链接，全基因组扩增等多个步骤，每一步骤的目标是要每个分子都以相同的效率执行每个步骤，打断有损失，连接有差别，扩增有偏好，都会带来检测误差。快速检测方法是指从样品制备到出具检测结果的整个检测过程能够在短时间内完成的检测方法。长沙水体微生物多样性测序诊断

病毒宏基因组测序是在宏基因组学理论的基础上,结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。而所谓宏基因组学(metagenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作。广州病毒宏基因组测序检测微生物的检测可以通过显微镜直接观察。

新发人畜共患病呈现逐年递增的趋势，人类想要征服新发人畜共患病，就必须提前发掘潜在的新的致病的病原，并针对新病原进行基因组分析、流行病学调查、致病机制及疫苗开发等方面的研究。病毒宏基因组学是在宏基因组学基础上发展起来研究特定环境中病毒的新兴技术，该技术结合深度测序技术（第二代、第三代测序技术）已经在人类、动物、特定环境中挖掘出大量的新病毒，该技术不依赖于病毒培养及病毒序列，在国内外被普遍应用于新发人畜共患病病原的挖掘与临床诊断。就病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展进行了介绍。

目前技术的进一步成熟，未来二代测序病原体检测应进一步在成本下降、诊断标准完善、质量控制提升等方面进行完善。同时应进一步增加大样本量的研究，以建立中国传染病原体宏基因组学检测的标准规范。对于怀疑神经系统急性传染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16～20℃冰箱。在完成常规生物化学检查和培养之后，若3d内未获得明确的病原学依据且经验性抗传染无效，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本（Ａ，Ⅱ）。微生物检测涉及多行业和领域，在实验室检测中有着重要的地位。

病毒宏基因组学中包含兆级的短序列片段（Reads）。通过不同的序列拼接软件将Reads拼接较长的DNA序列片断（Contigs）。数据组装可通过K-mer分析评估各个样品的测序深度，通过对SOAPdenovo设置不同K值，筛选较好组装结果，对较好组装结果进行校正，并统计Reads利用率。接着利用已测序生物体的DNA序列构建数据库，将拼接后的Contigs通过不同的鉴定方案，与数据库里的DNA序列信息进行比对，确定该序列来自的生物群落，筛选有用的基因信息。此外，还可以用一些工具对序列进行基因预测（如Metagene、GeneMark、FragGeneScan等）。微生物鉴定的用途：医疗保健：准确、快速地鉴定细菌和寄生虫，以进行正确和及时的疾病诊断。宏基因学分析原理

宏基因组测序以特定环境中的整个微生物群落作为研究的对象，不需对微生物进行分离培养.长沙水体微生物多样性测序诊断

优化临床制备病毒宏基因组测序所用样本的方法：①介绍高通量病毒宏基因组测序的样本制备步骤，对临床样本的总核酸进行随机扩增；②检测了从血浆样本中富集/扩增DNA及RNA病毒的不同方法，一种包括过滤、核酸酶消化、在不同反应中随机扩增DNA及RNA的步骤是较好的；③随后在包含了不同病毒科的样本中验证此方法，可高读数地检测到大多数病毒序列，且优于现行的其它样本制备方法；④该方法不只适用于血浆样本，还可用于尿液、咽喉拭子等临床样本。长沙水体微生物多样性测序诊断

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